聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）?

原理?

DNA的半保留復(fù)制時，雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對

原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗條件下，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。?PCR由變性-退火(復(fù)性-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：?

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；?

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至40~60℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；?

③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)就可獲得更多的?半保留復(fù)制鏈?，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。??

PCR技術(shù)分類（常用）?

（1）反向PCR技術(shù)(Inverse?PCR,?IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法．主要原理是用一種在已知序列中無

切點的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA．后酶切片段自身環(huán)化．以環(huán)化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性DNA的片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段?。?

（2）錨定PCR技術(shù)(Anchored?PCR,?APCR)：用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3’-末端加上一段已知序列,?然后以此序列為引物結(jié)合位點對該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,?稱為APCR。?

（3）不對稱PCR技術(shù)(asymmetric?PCR)：兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術(shù)稱不對稱PCR。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度,?常用50～100÷1比例。在初的10～15個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA,?但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后,?高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈DNA。?

（4）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(reverse?transcription?PCR,?RT-PCR)：當(dāng)擴(kuò)增模板為RNA時,?需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA

才能進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用非常廣泛,?無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗等都經(jīng)常采用。?

（5）巢式PCR技術(shù)(NEST-PCR)：先用一對靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量,?然后再用一對內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的PCR帶,?此為巢式PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PCR。為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長些,?且用量較少,?同時在次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度,?這樣在次PCR時,?由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合,?故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物,?經(jīng)過若干次循環(huán),?待外引物基本消耗盡,?無需取出次PCR產(chǎn)物,?只需降低退火即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟,?同時也降低了交叉污染的機(jī)會。這種PCR稱中途進(jìn)退式PCR，主要用于極少量DNA模板的擴(kuò)增。?

（6）多重PCR技術(shù)(multiplex?PCR)：在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴(kuò)增幾種基因片段,如果基因的某一區(qū)段有缺失,則相應(yīng)的

電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。?

（7）重組PCR技術(shù)：重組PCR技術(shù)是在兩個PCR擴(kuò)增體系中,?兩對引物分別由其中之一在其5’-端和3’-端引物上帶上一段互

補(bǔ)的序列,混合兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)變性和復(fù)性,兩組PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR?條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng),產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。?

（8）原位PCR技術(shù)：利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的

檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。?

（9）熒光定量實時PCR技術(shù)

反應(yīng)動力學(xué)?

????PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升，終DNA擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n

計算，Y代表DNA的片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴(kuò)增效率，n表示循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率理論值為100%，但實際情況達(dá)不到，反應(yīng)初期靶序列DNA的片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA的片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)?停滯效應(yīng)?，此效應(yīng)稱平臺期，與DNA聚合酶數(shù)量和活性、PCR擴(kuò)增效率、非特異性產(chǎn)物的競爭等因素有關(guān)。??

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?

????可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分，短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短、長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不同而形成的，以一個原始模板為例，在個反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點，長短不一，這就是長產(chǎn)物片段。進(jìn)入第二個反應(yīng)周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（長產(chǎn)物片段）結(jié)合引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，故這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點、止點都限定于引物擴(kuò)增的序列以內(nèi)，形成長短一致的短產(chǎn)物片段。由于短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，故可忽略不計，使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需再純化既可以保證足夠純的DNA的片段供分析、監(jiān)測。??

反應(yīng)五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四種dNTP、Mg2+?

（1）引物設(shè)計？?

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。??

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。??

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC理想隨機(jī)分布，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能超過3個，一對引物間也不易多于四個連續(xù)堿基的互補(bǔ)性?！疽锏腉C含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)：Tm=4（G+C）+2（A+T）】?

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3’端為關(guān)鍵堿基，是PCR延伸的起始端，不能進(jìn)行任何修飾，也不能形成二級結(jié)構(gòu)的可能，一般3‘端也不能發(fā)生錯配，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。5’端無嚴(yán)格限制，只起限定PCR產(chǎn)物長度的作用，對擴(kuò)增特異性影響不大，因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物。?

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，?被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。??

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。?

⑧引物量：?每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。?

（2）DNA聚合酶：目前有兩種Taq?DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量0.5-2.5?U/50?ml，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。??

（3）dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M?NaOH或1M?Tris-HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(?等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。??

（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：?溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS?還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；?蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。?

（5）Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq?DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

RT-PCR--是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。?

①總RNA提?。?70℃保存）?

Trizol法：?

1、取組織100㎎于玻璃勻漿器中，加入1ml?Trizol?冰上抽打勻漿（邊勻漿邊暫停）?

2、移入1.5mlEP管中，顛倒混勻，室溫保存5min?

3、加0.2ml（總體積的1/5），振蕩混合，室溫放臵5min?

4、4℃，離心12000?rpm，15min??

5、取上層液相（約400μl）移入一新1.5ml?EP管中，加等體積異丙醇（約400μl）,振蕩混合，室溫保存10min?

6、4℃，離心12000?rpm，10min?

7、棄上清液，加1ml?75%無水乙醇（4℃保存），振蕩混合?8、4℃，離心7500?rpm，5min?

9、棄上清液，室溫放臵20min(EP管倒臵在濾紙上)使RNA沉淀干燥（不能*干燥）?

10、加20ul?DEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（?可保存在液氮或低溫冰箱-70℃）??

測RNA濃度：走RNA變性電泳觀察18s、28s條帶，分光光度計檢測260/280吸光度比值?

調(diào)零：750ul?DEPC水?

測量：745ul?DEPC水?+?5ul?RNA?

總RNA濃度=?OD260×40×稀釋倍數(shù)（150倍）ug/ml?????????????

                =?OD260×40×150?ug/ml?????????????

                =?OD260×6?ug/ul?

A1/A2應(yīng)在1.8-2.0之間?

注意：提取RNA的質(zhì)量主要是要通過260/280的比值看是不是在2.0左右，當(dāng)OD260/OD280<1.8時提示有蛋白或酚的污染，需要進(jìn)一步純化RNA；還要跑膠看看28s、18s、5s的三條帶是不是清晰，一般質(zhì)量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，后一條5s的應(yīng)該比較淡。???

②逆轉(zhuǎn)錄RT（cDNA：一周內(nèi)-20℃保存，長期-70℃保存）?

RT反應(yīng)體系：20ul體系?

步：約20分鐘?

RNA抽提物????????????5μl?

Radome引物???????????2μl?

RNAsin??????????????0.5μl?

1、65℃?15分鐘??

2、立即放入冰浴???

第二步：約2小時?

RNAsin??????????????0.5μl?

10mM?dNTP?????????1μl?

5×?RT緩沖液??????????4μl?

25mM?MgCl2?????????4μl??????

AMV???????????????? ?3μl?

1、37℃?1.5小時??

2、94℃?5-10分鐘??

3、反應(yīng)物保存于-20℃或進(jìn)行PCR